Jakosc starterow pcr

Gdzie moge znalezc jak wplywaja rozne czynniki na jakosc startera? Np temperatura topnienia, zawartosc gc itp?

jakość?

są programy, które pomagają projektować startery - podają czy będą tworzyć jakieś spinki, czy będą one korzystne energetycznie itp, wyliczają temp. topnienia...

tu jest jakaś baza z programami do primerów: http://www.science.co.il/biomedical/primer-tools.asp

jak mocno Ci zależy, to mogę spróbować odgrzebać program, który używałem rok temu na praktykach do tego rodzaju zabawy, ale chyba znajdziesz wcześniej coś dla siebie w necie

program juz napisalem, gorzej z tym z podstawami teoretycznymi i musze jakies komentarze do tego napisac, ze np przy wyzszej temperaturze dzieje sie to i to, gdy jest za duzo gc to to i to.....

eee, piszesz program do primerów? Jakieś zadanko z programowania, czy jak? Aha - i ile wiesz o PCR?

w skrócie:
większa ilość par GC=wyższa temp. topnienia primera (czyli kiedy rozpada się na dwie nici).
te rzeczy z temperaturą pachną mi po prostu kolejnymi etapami cyklu PCR - na wiki powinno wszystko być - jak wiki nie wystarczy to pisz śmiało, pomogę

Ale teraz ile powinna wynosic temperatura topnienia, gdzies wyczytalem ze 60 stopni, ale co w przypadku jak jest np 52 stopnie? Czemu to sprzyja, bo jesli wyzsza to wydaje mi sie ze starter mozna wyrzucic, ale co w przypadku jesli jest o pare stopni nizsza?

można stosować różne temperatury, ta 60tka jest podana orientacyjnie, po prostu będziesz miał wyższą temp. annealingu. I tak używa się ok. 96 stopni do denaturacji matrycowego DNA wcześniej, więc mieszaninie nic się nie stanie.

Im wyższa temp. topnienia, tym dwie nici primera silniej wiążą się do siebie, jak i (o ile są dobrze zaprojektowane) do matrycy; dla niższej temp. będą wiązać się słabiej, więc może pojawić się problem z odłączaniem się primera w czasie podwyższania temp. przy przechodzeniu do fazy elongacji.

wydaje mi się, że gdzieś słyszałem o takiej odmianie pcr'a, gdzie pomijasz etap annealingu - tzn. nie obniżasz temp. do tych ~60 stopni, tylko przechodzisz od razu do 72 - wtedy od razu po przyłączeniu się primera następuje synteza nowej nici. Koszt jest taki, że mniejsze są szanse na przyłączenie się primerów (czyli de facto przyłączy się ich mniej); zysk był chyba taki, że było mniej niespecyficznych produktów (ale za ten akapit nie dam sobie głowy uciąć)

może to Ci jeszcze pomoże: http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/start.html

Nastepny moj problem, prowadzacy program zaliczyl po czym narysowal sekwencje

GCATT..........GTTAA

i kazal podac sekwencje primarow do namnozenia fragmentu-...........
Jakie powinny byc te sekwencje, podalem komplementarne i stwierdzil ze zle.........

może chodziło mu o to, że taki primer jest za krótki - takich sekwencji jak masz tam podane może być sporo w matrycy, więc prawdopodobnie pojawią się inne produkty niż to co chciałeś. Normalnie primery mają ~ kilkanaście pz i więcej


kilka innych wskazówek do projektowania (m.in. zawartość i umiejscowienie GC):
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

nie o to chodzilo, dalej nie wiem o co i mam rozne zrodla. W podstawach biologii komorki jest ze namnozeniu poddawany jest fragment pomiedzy starterami, natomiast w biologia molekularna- urszula mazurek, ze fragment pomiedzy+startery, dalej w podstawach pisze ze startery maja byc komplementarne po obu stronach we wspomnianej juz mazurek ze 1 starter ma byc komplementarny do 3 prim, drugi natomiast komplementarny do 3' nici nonsensownej, czyli wynika na to ze taki sam jak 5' matrycy. Wiec juz calkiem nie wiem jak jest, a zdac trzeba:(........ Nastepne pytanie czy polimeraza zaczyna od 3 czy od 5' matrycy?

powielany jest pomiędzy + startery (co jest z resztą przydatne, ale mniejsza o to)



zgadza się, tak to wygląda (jeśli nie wchodzisz w szczegóły - bo starter nie musi być koniecznie komplementarny, może cośtam się różnić, szczególnie koniec 5' startera, tam możesz wrzucić dużo rzeczy)

primer1:                          <<<- 3' yyyy 5'         
matryca:   5' xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 3'
matryca:   3' yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5'
primer2:   5' xxxx 3' ->>>

ta druga nić matrycy to nić nonsensowna, strzałki oznaczają kierunek dobudowywania nukleotydów