Identyfikacja, detekcja GMO

Identyfikacja roślin modyfikowanych genetycznie testem immunoenzymatycznym (ELISA) polega na wykryciu aktywnego enzymu fosfotransferazy kanamycyny (lub inaczej: neomycynowa fosfotransferaza II), produktu genu selekcyjnego NPT II. Łącznie z właściwym genem, nadającym roślinie nową właściwość (np. odporność na szkodniki) wprowadzany jest także gen selekcyjny, dzięki któremu można szybko rozpoznać, które komórki roślinne uległy modyfikacji, a które nie.

Potrzeba jego stosowania wynika z fakty, iż wydajność modyfikacji genetycznych jest niewielka, rządu kilku procent (a nawet mniej). Próbuje się modyfikować tysiące komórek, z czego tylko w kilku-kilkudziesięciu niesiony gen uda się wprowadzić do wnętrza komórki i zintegrować z genomem rośliny. Powszechnie używany gen NPT II koduje fosfotransferazę kanamycyny - enzym, który inaktywuje antybiotyk - kanamycynę. Kanamycyna dzięki toksyczności wobec komórek roślinnych jest wykorzystywana jako czynnik selekcyjny. Po próbie modyfikacji, komórki roślinne są przenoszone na pożywkę zawierającą kanamycynę. Komórki, które uległy modyfikacji zawierają obok właściwego genu, także gen odpowiedzialny za inaktywację antybiotyku, dzięki czemu są wystanie urosnąć na pożywce selekcyjnej. Komórki w których nie zaszła modyfikacja, czyli które nie zawierają oporności na antybiotyk, zamierają.

Genetycznie modyfikowana Arabidopsis thalianaGen NPT II ten jest powszechnie używanym przy modyfikacji roślin markerem zajścia modyfikacji, jednak nie jest jedynym genem selekcyjnym. Zatem identyfikacja roślin transgenicznych badająca obecność aktywnej fosfotransferazy kanamycyny ogranicza się do identyfikacji roślin zawierających gen NPT II. Kolejnym ograniczeniem metody immunoenzymatycznej jest to, iż badane białko (w tym przypadku enzym) musi być natywne (aktywne, niezdeneturowane). Zaletą jest prostota i szybkość doświadczenia, nie ma konieczności wykorzystywania drogich urządzeń laboratoryjnych.

Fosfotransferaza kanamycynyInnym typem identyfikacji GMO jest metoda oparta na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Polega ona na detekcji fragmentów wprowadzonych podczas modyfikacji w oczyszczonym DNA rośliny. Metoda ta jest bardziej skomplikowana niż test ELISA, doświadczenie wiąże się z większymi kosztami, dostępem do dość drogiego sprzętu.

Detekcja modyfikacji genetycznej - GMO - na podstawie reakcji ELISA

Gen NPT II

Nazwa genu NPT II pochodzi od białka jakie koduje Neomycin PhosphoTransferase II (neomycynowa fosfotransferaza II, inaczej: fosfotrasnferaza kanamycyny). Enzym drugi II jest szerzej stosowany niż z oznaczeniem: I. Pierwotnie gen NPT II został wyizolowany z transpozonu piątego (Tn5) z bakterii Escherichia coli K12. Gen ten jest prawdopodobnie najczęściej stosowanym genem markerowym przy modyfikacjach genetycznych roślin.

Fosfotransferaza kanamycyny

Fosfotransferaza kanamycyny (EC 2.7.1.95) jest małym białkiem bakteryjnym (24kD). Przeprowadza reakcję fosforylacji kanamycyny (przeniesienia grupy fosforanowej z ATP na kanamycynę z powstaniem ADP), przez co uniemożliwia jej związanie się z robosomem - antybiotyk traci swoją toksyczność. Wykazuje aktywność wobec takich antybiotyków aminoglikozydowych jak: kanamycyna, neomycyna, gentamycyna (G418) i paromomycyna. Inne nazwy to: kinaza kanamycyny, neomycynowa fosfotransferaza, aminoglikozydowa 3*-fosfotransferaza.

Fosfotransferaza kanamycyny, kinaza kanamycyny, neomycynowa fosfotransferaza

Test ELISA w identyfikacji GMO

Test Elisa jest testem studzienkowym, których powierzchnia jest opłaszczona przeciwciałami skierowanymi wobec badanego białka - w tym przypadku enzymu fosfotransferazy kanamycyny. Po roztarciu tkanki roślinnej i umieszczeniu jej w studzienkach następuje związanie uwolnionego z komórek enzymu z przeciwciałami opłaszczonymi na powierzchni studzienek. Następnie dodawane jest kolejne przeciwciało związane z enzymem, które także wiąże się z fosfotransferazą kanamycyny. Enzym związany z wprowadzanym przeciwciałem ma za zadanie przeprowadzić reakcję, dającą barwny produkt - możliwy do detekcji spektrofotometrem. Enzymem tym jest często peroksydaza chrzanowa (HRP). Substratem, który przeprowadzany jest barwny produkt może być tetrametylobenzydyna (TMB). Powstały produkt będzie barwy żółtej, a intensywność zabarwienia roztworu w studzience jest proporcjonalna do ilości związanej fosfotransferazy kanamycyny.

Detekcja modyfikacji genetycznej organizmów transgenicznych GMO ELISA