SSCP

SSCP - (single strand conformation polimorphism) - technika biologii molekularnej stosowana w wykrywaniu mutacji. Jest to metoda badania polimorfizmu konformacyjnego jednoniciowego DNA.

Badany DNA jest amplifikowany klasyczną techniką PCR, uzyskany produkt amplifikacji jest denaturowany do jednoniciowego DNA, a następnie poddawany elektroforezie w żelu akrylamidowym, w warunkach niedenaturujących.
W wyniku wewnątrzniciowego parowania zasad ss DNA zgina się w trójwymiarową strukturę. Pojedyncze nici równej długości, ale różniące się sekwencją mogą wykazywać różnice w ruchliwości elektroforetycznej. W konsekwencji po elektroforezie widoczne są różnice w odległości pomiędzy nićmi DNA normalnego, a DNA zmutowanego.
Pojedyncze różnice w sekwencji, spowodowane mutacją punktową, wywołują zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie w żelu poliakrylamidowym.

Etapy SSCP:
1. Amplifikacja. DNA amplifikowane w reakcji PCR. Maksymalną skuteczność wykrywania mutacji osiąga się badając DNA o długości 150-200 nukleotydów.

2. Denaturacja. dsDNA jest denaturowane pod wpływem silnej zasady lub poprzez połączenie działania formamidu oraz wysokiej temperatury.

3. Elektroforeza. Zdenaturowane DNA rozdzielane jest elektroforetycznie w warunkach niedeneturujących. Ponieważ analizowane cząsteczki DNA różnią się właściwościami elektroforetycznymi należy tak przygotować żel, aby po przeprowadzeniu elektroforezy można było odróżnić konformery.
Ważnym jest dobranie odpowiednich warunków elektroforezy (stężenie buforów, temperatura, dodatek związków wspomagających właściwości elektroforetyczne pojedynczych nici). W zależności od długości badanego materiału istotne znaczenie ma koncentracja akrylamidu.

4. Wykrywanie. Konformery pojedynczych nici identyfikowane są w żelu poprzez np. wybarwienie bromkiem etydyny.

Dodane przez: Adrianna

Wydrukuj