Klonowanie, metody klonowania

Owca Dolly została sklonowana metodą transplantacji jąder komórkowych.

Metody klonowania ssaków

Opracowanych jest kilka metod klonowania ssaków. Do klonowania zarodków - czyli jeszcze nie zróżnicowanych komórek - stosuje się metody: izolacji blastomerów, reagregacja blastomerów, dzielenie zarodków, czy transplantacja jąder komórkowych. Ta ostania metoda jest także stosowana do klonowania somatycznego, czyli takiego w którym wykorzystywane są komórki pochodzące z osobników dorosłych. Tą metodą właśnie została sklonowana - jako pierwszy ssak - w 1996 roku owca Dolly.

Klonowanie zarodków metodą izolacji blastomerów.

Polega na usunięci osłonki przejrzystej zarodka gdy występuje on w stadium 4-komórkowym - składa się z 4 blastomerów (wykorzystywane też są czasami zarodki składające się z 2, lub 8 blastomerów), a następnie umieszczeniu w pożywce pozbawionej jonów magnezu i wapnia, co powoduje osłabienie połączeń pomiędzy blastomerami i rozdzielenie się ich. Następnie rozdzielne blastomery hoduje się w warunkach in vitro do momentu uzyskania przez nie stadium moruli lub blastocysty. Następnie wszczepie się je do macicy samicy-biorcy.
Klonowanie tą metodę jest jednak mało skuteczne. Jest to metoda czysto laboratoryjna.

Klonowanie zarodków metodą dzielenie (bisekcji).

Polega na przecięciu zarodków występujących w stadium moruli lub blastocysty odpowiednie przygotowanym skalpelem. Jest to zabieg stosunkowo prosty, dzieli się zarodek na dwie równe części, i po krótkiej hodowli in vitro przeszczepie się je do samic-biorczyń.
Ograniczeniem tej metody jest możliwość uzyskania tylko dwóch identycznych genetycznie osobników - dzielenie zarodka na 3, 4 i więcej części nie przynosiło rezultatów.

Klonowanie zarodków metodą reagregacji blastomerów (klonowanie chimerowe).

Organizm chimerowy - chimera - jest to organizm złożonych z komórek pochodzących z dwóch lub więcej, organizmów, czyli pochodzący z komórek różniących się pod względem genetycznym i genotypowym.

Klonowanie chimerowe opiera się na hipotezie inside-outside, wg której zewnętrznie położone komórki zarodka wytwarzają trofoblast (odpowiedzialny za implantację w ścianie macicy), a z komórek będących wewnątrz, odizolowanych od środowiska zewnętrznego, rozwinie się ostatecznie przyszły osobnik. W metodzie tej pojedyncze blastomery wyizolowane wcześniej z zarodka klonowanego (zwykle 4 lub 8 komórkowego) otacza się innymi blastomerami - tzn. blastomerami nośnikowymi. Następnie po hodowli in vitro wszczepie się taki już chimerowy zarodek do samicy-biorcy.
Metoda ta mimo że pozwala na uzyskanie większej liczby klonów pozostaje jednak metodą czysto laboratoryjną, ze względu na duże trudności z hodowlą i przeżywalnością agregowanych blastomerów.

Klonowanie metodą transplantacji jąder komórkowych.

Jest to najczęściej wykorzystywana metoda klonowania. Jest jedyną która pozwala na sklonowanie dorosłych osobników, oraz umożliwiająca uzyskanie wielu klonów. Ta właśnie metodą sklonowana została owca Dolly.

Polega na usunięciu jądra komórkowego z niezapłodnionego oocytu (komórki jajowej) i wszczepieniu jądra z innej komórki - pochodzącej z organizmu jaki chcemy klonować. Jądro można obierać z komórek zarodka, z komórek hodowanych in vitro, a także co najważniejsze w tej metodzie, z dorosłych już osobników. W przypadku Dolly były to komórki pochodzące z wymienia jednej z owiec.

Pierwszym etapem tej metody klonowania jest usuniecie jądra z niezapłodnionego oocytu. Zabieg polega na mikrochirurgicznym usunięciu chromosomów ułożonych w płytce metafazowej II podziału mejotycznego. Następnie izoluje się jądra z komórek które chcemy klonować. W przypadku klonowania zarodków będą to blastomery, a przypadku chęci sklonowania dorosłego osobnika będą to komórki pochodzące z różnych tkanek. Kolejnym etapem jest wprowadzenie wyizolowanego jądra do oocytu, z którego wcześniej usunięto jego własne jądro. Zabieg ten można przeprowadzić metodą mikrochirurgiczną - polegającą na bezpośrednim wprowadzeniu jądra do komórki jajowej za pomocą mikromanipulatora, lub metodą niechirurgiczną - za pomocą inaktywowanego wirusa Sendai (wirus z grupy wirusów grypy) albo poprzez elektrofuzję, czyli za pomocą impulsów pola elektrycznego. Oocyt z umieszczonym wcześniej jądrem pod osłonką przejrzysta umieszcza się w roztworze dielektryku pomiędzy dwoma elektrodami. Impulsy prądu stałego powodują fuzję. Ta metoda jest najpowszechniej stosowana na świecie - zastosowano ją także przy klonowaniu Dolly.

Następnie aktywuje się oocyt - czyli pobudza go do rozwoju. W tym celu stosuje się czynniki chemiczne: np. alkohol etylowy, lub fizyczne: np. impulsy prądu stałego. W końcu rozwijający się zarodek wszczepie się do macicy samicy-biorcy.

KlonowanieOwca Dolly - pierwszy sklonowany ssak
Pierwsze próby klonowania
Klonowanie - aktualności, newsy, doniesienia.