Przeprogramowanie komórek somatycznych jako alternatywa wobec sporów etycznych wokół komórek macierzystych

Hodowla pierwotnych komórek macierzystych człowieka z jednej strony stwarza szansę na opracowanie terapii nieuleczalnych dotąd chorób, jak cukrzyca, choroba Parkinsona czy dysfunkcje układu odpornościowego, z drugiej wywołuje falę sporów na temat dopuszczalności badań na ludzkich zarodkach. Kością niezgody jest ustalenie statusu ludzkiego zarodka, czyli od którego momentu po zapłodnieniu mamy do czynienia z istotą ludzką.

Pomimo licznych debat w gronie naukowców, nie ma szans na uzyskanie jednolitych poglądów na prowadzenie badań nad komórkami macierzystymi. Brak możliwości ustanowienia jednego stanowiska, wiąże się z płynącymi korzyściami bądź też ich silnym ograniczeniem dla poszczególnych grup środowiskowych. Wchodząc w tą dyskusję przeciwstawiamy sprawy światopoglądowe i religijne z racjonalnymi argumentami medycznymi.

Wobec zastrzeżeń etyczno-moralnych dotyczących zastosowania zarodkowych komórek macierzystych w celach badawczych, w laboratoriach rozpoczęto prace nad przeprogramowaniem genomu komórek somatycznych, takich jak np. fibroblasty skóry.

Przeprogramowanie komórek somatycznych zachodzi poprzez regulację ekspresji genów na poziomie struktury chromatyny, w wyniku procesu acetylacji (dołączenie grup acetylowych CH3-CO-) i demetylacji (odłączenie grup metylowych -CH3).

W każdej komórce ciała występuje taka sama sekwencja DNA. Część tej struktury jest bardzo zwarta i tym samym niedostępna dla czynników transkrypcyjnych regulujących ekspresję genów. Podczas rozwoju organizmu dochodzi do modyfikacji struktury przestrzennej chromatyny. Kwas DNA oraz histony mogą ulegać fosforylacji, acetylacji, metylacji oraz ubikwitynacji. Szczególnie ważną zmianą epigenetyczną DNA jest przyłączenie grup metylowych do zasad azotowych nukleotydów, w szczególności do cytozyny w pozycji 5. Produktem metylacji cytozyny jest 5-metylocytozyna. Znakowany w ten sposób obszar przekształca się w heterochromatynę niedostępną dla czynników transkrypcyjnych, co powoduje zablokowanie ekspresji genów. U ludzi wzór metylacji jest wymazywany w zygocie i ponownie generowany przed rozpoczęciem procesu gastrulacji. Odwrócenie tego procesu zachodzi poprzez zastosowanie klonowania terapeutycznego poprzez transfer jądra (ang. SCNT, somatic cell nuclear transfer), czyli fuzji komórki somatycznej z oocytem pozbawionym uprzednio jądra. Drugą metodą jest połączenie komórki somatycznej z pozbawioną materiału genetycznego embrionalną komórką macierzystą (ang. ESC, embrional stem cells). Przeprogramowanie genomu komórek somatycznych jest możliwie, ponieważ ESC jak i oocyty zawierają enzymy pozwalające usunąć reszty metylowe oraz dołączyć grupy acetylowe do histonów, tworząc rozwiniętą strukturę nukleosomu sprzyjającą transkrypcji.

W 2004 roku grupa badawcza ze Scripps Research Institute, wykazała, że w mięśniach mysich odwrócenie różnicowania komórek jest możliwe. Dochodzi tutaj do przekształcenia, budujących mięsień mysi komórek w komórki kostne lub tłuszczowe. Proces odróżnicowania był możliwy dzięki zastosowaniu małej cząsteczki chemicznej zwanej rewersyną. Niestety proces działania tej cząsteczki nie jest do końca poznany, co zabrania zastosowania jej na szerszą skalę, poza pracami naukowymi. Badania prowadzi się także na otoczeniu komórek macierzystych tzw. niszach. A.Spradling i T.Kai z Carnegie Institution of Washington skoncentrowali swoje badania na bodźcach sygnałowych płynących do komórek macierzystych z otaczających je nisz. Swoją uwagę skupili głównie na badaniach najbardziej plastycznej komórki macierzystej, jaką jest zapłodniona komórka jajowa. Obiektem ich eksperymentów były komórki macierzyste u Drosophila melanogaster. Wpływając na sygnały chemiczne docierające do tych komórek, wywołali ich różnicowanie a następnie odwrócenie tego procesu. Takie wyniki potwierdzają spekulacje, że sygnały środowiskowe są jednym z czynników stymulujących macierzysty charakter komórek.

Najbardziej zaawansowane badania przeprowadzane są nad jąderkami przeprogramowanych fibroblastów skóry. W 2006 roku Takahashi i Yamanaka wykazali, że komórki pluripotentne można uzyskać z dowolnej komórki somatycznej. Naukowcy metodą inżynierii genetycznej wprowadzili, do komórek fibroblastów mysich i ludzkich czynniki transkrypcyjne Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc (OSKM) i uzyskali indukowane pluripotentne komórki macierzyste (iPSC, induced pluripotentstem cells).

Od momentu powstania pierwszych komórek iPSC naukowcy prześcigają się w opracowywaniu metod otrzymywania tych komórek, które będą bardziej efektywne i bezpieczne w kontekście przyszłych badań klinicznych. Już w 2007 roku Thomson razem ze współpracownikami przeprogramowali ludzkie fibroblasty, używając odmiennego zestawu czynników transkrypcyjnych zawierających Oct4, SOX2, Nanog i LIN28 (OSNL), zaznaczając, że Klf4 i c-Myc mogą być zastąpione przez Nanog i LIN28. Zestaw OSNL stał się wówczas pierwszym zestawem czynników wykluczających onkogenny charakter Klf4 oraz c-Myc. Dwa lata później naukowcy pod kierunkiem Ng opracowali metodę wprowadzania do komórek białek rekombinowanych OS oraz Esrrb. Esrrb to receptor jądrowy, należący do rodziny tzw. sierocych receptorów, czyli takich, dla których nie zidentyfikowano ligandu. Esrrb reguluje ekspresję genów Oct4, Sox2 i Nanog. W tym samym roku, grupie badawczej pod kierunkiem Schöler’a udało się ograniczyć liczbę wymaganych białek rekombinowanych w procesie przeprogramowania genomu komórek i tym samym zminimalizować ryzyko, jakie niesie ze sobą integracja transgenu w DNA. W swoim doświadczeniu użyli tylko jednego czynnika Oct4, który zdołał przeprogramować neuralne komórki macierzyste (NSC, neural stem cells) do iPSC. Należy tutaj jednak zwrócić uwagę na fakt, którym jest stopień zróżnicowania komórki. Im komórka jest bardziej wyspecjalizowana tym trudniej zachodzi proces odróżnicowania. Schöler w swoim doświadczeniu użył komórek pluripotentnych, czyli takich, które mogą dać początek każdemu typowi komórek dorosłego organizmu, w przeciwieństwie do komórek unipotentnych różnicujących się do jednego typu komórek.


Podejmuje się również próby opracowania metody, która wyklucza genetyczną manipulację oraz wprowadzanie białek. Badane są związki organiczne odgrywające rolę w procesie przeprogramowania, takie jak kwas walproinowy, który jest inhibitorem enzymu deacetylazy histonów. Opracowanie zestawu takich związków spowodowałoby, że proces uzyskiwania iPSC podlegałby łatwiejszej kontroli i byłby znacznie tańszy.

iPSC wykazują podobieństwo do ESC pod wieloma względami, takimi jak, taka sama morfologia, ekspresja genów, białek i receptorów czy potencjał do różnicowania. To bliskie podobieństwo iPSC z ESC staje się tym samym argumentem dla bioetyków, którzy sugerują ostrożność w fascynacji nową metodą. Otrzymywanie iPSC nie wiąże się z niszczeniem embrionu, a cała procedura ma szczytny cel – opracowanie terapii nieuleczalnych dotąd chorób, dlatego technika ta może się wydawać etycznie dopuszczalna. Z drugiej strony, w dużej mierze nieograniczone prawnie możliwości otrzymywania iPSC, dały naukowcom możliwości przy przeprogramowaniu komórek somatycznych do stadium embrionu, co nasuwa wiele pytań natury etycznej.

Należy wierzyć, że wkrótce zostanie osiągnięty kompromis, co do przyszłych manipulacji nad iPSC, co oznacza stworzenie listy dopuszczalnych metod wydajnego otrzymywania i różnicowania wspomnianych komórek. Aspekt standaryzacji metod jest równie ważny, nie tylko w kontekście etycznym, ale również możliwości aplikacyjnego zastosowania iPSC w personalizowanej terapii komórkowej oraz przy opracowywaniu testów toksykologicznych i farmakologicznych.


Bibliografia
1. Bo Feng, Jia-Hui Ng, Jian-Chien Dominic Heng, Huck-Hui Ng, Molecules that Promote or Enhance Reprogramming of Somatic Cells to Induced Pluripotent Stem Cells, Cell Stem Cell 2009, 301-312;
2. Dominic J. Ambrosi, Borko Tanasijevic, Anupinder Kaur, Craig Obergfell, Rachel J. O’Neill, Windfried Krueger, Theodore P. Rasmussen, Genome-Wide Reprogramming in Hybrids of Somatic Cells and Embryonic Stem Cells, Stem Cells 2007, 25:1104-1113;
3. Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996;380:64–66;
4. Jeanisch R, Eggan K, Humpherys D, Rideout W, Hochedlinger K, Nuclear cloning, stem cells, and genomic reprogramming, Cloning Stem Cells 2002, 4:389-96.